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关键词： 猫   CD44   原核表达   单克隆抗体   制备   鉴定  

摘要： 为制备用于实验的猫CD44单克隆抗体,原核表达了猫CD44重组蛋白,通过镍亲和层析法纯化目的蛋白,并将蛋白定量至1 mg/m L,然后将蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤抗体技术制备鼠抗猫CD44单抗,并验证单抗的适用范围。结果表明,成功制备并纯化4株猫CD44单抗,其效价均高于1∶64000,重链均为Ig G1型,轻链均为κ型。制备的单抗可应用于Western-blot、间接免疫荧光和免疫组织化学等实验,为猫CD44基因相关疾病的研究和药物研发等提供了重要的单克隆抗体资源。

关键词： 假交替单胞菌   κ-卡拉胶酶   免疫球蛋白样结构域   酶学性质   结构稳定性  

摘要： 目的:分析假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)来源κ-卡拉胶酶的结构域,构建结构域截短突变体,探究非催化结构域对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的酶学性质与结构的影响。方法:利用大肠杆菌异源表达假交替单胞菌κ-卡拉胶酶WT和仅包含糖苷水解酶催化结构域的κ-卡拉胶酶截短体GH(缺失免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)样结构域),利用3,5-二硝基水杨酸法研究κ-卡拉胶酶WT和GH的酶学性质,利用分子对接和分子动力学模拟研究酶微观结构的变化。结果:成功对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶WT及其截短体GH进行体外表达,WT和GH的分子质量分别为44.0 kDa和35.0 kDa,均能专一性地酶解κ-卡拉胶底物。酶学性质研究发现,假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的Ig样结构域不影响酶的底物特异性、最适反应温度、最适反应pH值和κ-卡拉胶酶解产物的组成,但降低了酶的热稳定性、强酸(pH 4.0)和强碱(pH 11.0)稳定性、酶对底物的亲和力。酶的分子对接及分子动力学模拟分析结果表明,Ig样结构域截短后,κ-卡拉胶酶与κ-卡拉胶四糖底物的相互作用增强,酶结构的刚性增强,κ-卡拉胶酶F1、F3和F5指状区环状结构柔性降低,F2和F6指状区β片层结构柔性升高,这些结构的改变可能是截短体GH催化活性和热稳定性提高的原因。结论:本研究解析了假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的非催化Ig样结构域与酶性质的构效关系,可为该酶结构与功能研究及酶的应用提供理论基础。

关键词： 诱导多能干细胞(iPSCs)   NKG2A   自然杀伤(NK)细胞   免疫治疗  

摘要： 目的针对NKG2A-HLA-E负调控通路,构建诱导多能干细胞(iPSC)来源的基因工程NKG2A敲除的NK细胞(NKG2A KO-iNK),在体外初步评价其肿瘤杀伤功能。方法利用基因编辑技术在iPSC中敲除NKG2A,将其在体外诱导分化为NKG2A KO-iNK细胞,并在不同分化阶段利用流式细胞测量术检测特异性的表面标志物;利用Western blot验证NKG2A KO-iNK细胞NKG2A的敲除情况,并用流式细胞测量术检测NKG2A KO-iNK细胞常见的NK细胞活化性受体及天然细胞毒性受体的表达水平;乳酸脱氢酶检测法(LDH)检测NKG2A KO-iNK细胞对不同人白细胞抗原E(HLA-E)表达水平肿瘤细胞的体外细胞毒活性。结果将Cas9蛋白和靶向编码NKG2A的KLRC1基因第1、2外显子的3条向导RNA(sgRNA)共转染iPSC对其进行基因敲除,测序结果显示成功获得在第1外显子插入1个T碱基的单克隆NKG2A敲除的iPSC(NKG2A KO-iPSC)。iPSC向NK细胞诱导分化的过程中,第8天类胚体(EBs)阶段检测CD34表达水平在30%~50%;第28天NK诱导分化阶段CD56和CD16的表达均达80%以上。Western blot结果显示,NKG2A KO-iNK细胞NKG2A被成功敲除;流式结果显示NKG2A KO-iNK细胞活化性受体NKG2D及细胞毒性受体NKp30、NKp44、NKp46的表达水平和野生型iNK(WT-iNK)细胞基本一致。LDH实验结果显示,NKG2A KO-iNK细胞对HLA-E高表达的B细胞前体白血病细胞系Nalm6的细胞毒活性显著高于WT-iNK细胞,而对HLA-E低表达的人骨髓瘤细胞系H929和HLA-E几乎不表达的人肝癌细胞系HepG2,NKH2A KO-iNK细胞和WT-iNK细胞两者之间的细胞毒活性差异无统计学意义;γ干扰素(IFN-γ)处理能显著上调Nalm6细胞的HLA-E表达水平,进而进一步增强NKG2A KO-iNK细胞对Nalm6细胞的细胞毒活性。结论由于阻断了NKG2A-HLA-E负调控通路,基因工程NKG2A KO-iNK细胞对HLA-E高表达的肿瘤细胞系在体外显示出明显增强的细胞毒活性,提示其作为一种新型细胞治疗的可能性,为肿瘤的细胞过继免疫治疗提供一种新的思路。

关键词： 糖尿病   WBC   C反应蛋白   白介素6   全膝关节置换  

摘要： 目的:探讨糖尿病对全膝关节置换术后WBC、CRP、ESR、IL-6等炎性指标的影响。方法:选取2022年1月-2024年10月我院关节外科行全膝关节置换的患者共80例,其中有糖尿病史患者40例,非糖尿病史患者40例,其中男性38名,女性42名。分为观察组和对照组,两组患者均在全身麻醉联合股神经麻醉下行全膝关节置换术。观察术前和术后1天、3天、30天WBC、CRP、ESR、IL-6的变化,记录患者术后发热及并发症情况。结果:观察组与对照组比较,患者血液中术前WBC、CRP、ESR、IL-6水平无明显差异(P>0.05)。术后第1天和术后第3天,观察组WBC、CRP、ESR、IL-6水平显著高于对照组(P<0.05)。术后30天,两组患者血液中WBC、CRP、ESR、IL-6水平无明显差异(P>0.05)。术后出现膝关节周围红肿、发热并发症率,观察组(57.5%)显著高于对照组(20.0%)。结论:糖尿病患者行全膝关节置换术后,血液中WBC、CRP、ESR、IL-6等炎性指标升高显著,感染风险增加,需及时调整、延长抗生素使用疗程,预防膝关节置换术后感染。

关键词： 口腔单纯疱疹病毒感染   Toll样受体9   髓样分化蛋白88   预后复发   相关性  

摘要： 目的分析口腔单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染患儿Toll样受体9(Toll like receptors 9,TLR9)、髓样分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)及相关细胞因子的表达水平,探讨HSV-1感染患儿TLR9、MyD88及相关细胞因子与预后复发的相关性。方法选取2021年1月至2024年6月在山东第一医科大学附属人民医院接受治疗的170例口腔HSV-1感染患儿,根据随访期间是否再次发生感染将患儿分为复发组和未复发组。采用实时荧光定量PCR技术检测患儿外周血中TLR9、MyD88 mRNA表达量;采用磁微粒化学发光法检测患儿血清白细胞介素(IL)-6、IL-10水平;通过logistic回归分析确定影响口腔HSV-1感染患儿预后复发的危险因素;Pearson相关性分析法用于评估TLR9、MyD88及相关细胞因子与口腔HSV-1感染患儿预后复发的相关性。结果根据随访检测结果,170例患儿中58例发生口腔HSV-1感染,纳入复发组;余下112例未发生口腔HSV-1感染,纳入未复发组。复发组患儿外周血TLR9、MyD88 mRNA及TLR9、MyD88共表达水平均高于未复发组[(95.75±5.47)%vs.(52.47±3.71)%、(70.59±4.32)%vs.(29.17±1.73)%和(71.53±5.75)%vs.(16.24±1.77)%],差异有统计学意义(P<0.05)。与未复发组比较,复发组患儿血清IL-6、IL-10水平明显升高[(82.16±6.47)pg/mL vs.(38.51±4.29)pg/mL,(6.37±0.94)pg/mL vs.(2.05±0.43)pg/mL],差异有统计学意义(P<0.05)。两组在免疫力低下、微量元素/维生素缺乏、密切接触感染源、TLR9、MyD88、IL-6以及IL-10水平方面比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,免疫力低下、微量元素/维生素缺乏、密切接触感染源、TLR9、MyD88、IL-6以及IL-10是口腔HSV-1感染患儿预后复发的主要危险因素(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,TLR9、MyD88、IL-6、IL-10与口腔HSV-1感染患儿预后复发均呈显著正相关(r=0.8591、0.8567、0.8371、0.8265,P<0.001)。结论口腔HSV-1复发感染患儿TLR9、MyD88、IL-6、IL-10水平均明显升高,TLR/MyD88信号通路可能在口腔HSV-1复发感染患儿预后复发机制中具有重要作用。

关键词： 扶正化瘀方   肝纤维化   淋巴细胞  

摘要： 目的探讨扶正化瘀方对肝纤维化小鼠外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)及肝内淋巴细胞(intrahepatic lymphocyte,IHL)亚群的影响。方法C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组(9只)和造模组(18只),造模组给予高脂饮食同时予以2 mL/kg体质量的剂量腹腔注射10%CCl_(4),正常组小鼠等量橄榄油腹腔注射。第3周将造模组分为模型组、扶正化瘀方组。造模同时,扶正化瘀方组小鼠给予扶正化瘀方(0.5 g干粉溶于20 mL ddH_(2)O,剂量为20 mL/kg)灌胃,正常组和模型组以等剂量双蒸水灌胃,均1次/d,共4周。第6周末麻醉处死小鼠,检测血清肝功能,HE、天狼猩红染色评价小鼠肝损伤及纤维化程度,肝组织冰冻切片免疫荧光染色观察CD_(4)^(+)T、CD_(8)^(+)T、NK定位。取小鼠外周血及肝组织制备单个核细胞悬液,用多色流式细胞术检测外周血及肝脏淋巴细胞亚群分布。结果扶正化瘀方能改善CCl_(4)联合高脂饮食诱导的模型小鼠肝功能,减轻肝组织炎症损伤和胶原沉积。免疫荧光染色表明CD_(4)^(+)T、CD_(8)^(+)T、NK细胞均向纤维间隔浸润,沿纤维间隔分布。与正常组相比,模型组小鼠外周血CD_(8)^(+)T显著升高[0.34(0.16 vs 0.59(0.27,P<0.05)],CD_(4)^(+)T/CD_(8)^(+)T、NK/CD_(8)^(+)T显著减少[(1.97±0.62)vs(1.46±0.17)、(4.45±1.41)vs(1.80±0.96),均P<0.05],肝内CD_(8)^(+)T显著升高[(3.70±1.21)vs(6.42±2.41),P<0.05],CD_(4)^(+)T/CD_(8)^(+)T显著减少[(1.05±0.14)vs(0.84±0.20),P<0.05];经扶正化瘀方治疗后,小鼠外周血中CD_(8)^(+)T较模型组显著减少[(0.37±0.16)vs(0.59±0.27),P<0.05],外周血NK、CD_(4)^(+)T/CD_(8)^(+)T、NK/CD_(8)^(+)T较模型组明显增加[(1.63±0.59)vs(0.96±0.30)、(1.73±0.36)vs(1.46±0.17)、(5.30±2.24)vs(1.80±0.96),P<0.05]。同时肝内NK、CD_(4)^(+)T/CD_(8)^(+)T、NK/CD_(8)^(+)T也较模型组明显增加[(4.35±0.98)vs(2.73±0.73)、(1.00±0.13)vs(0.84±0.20)、(0.73±0.21)vs(0.48±0.24),P<0.05]。结论扶正化瘀方抗肝纤维化作用机制可能与通过减少肝纤维化小鼠外周血中CD_(8)^(+)T比例,升高外周血及肝内NK、CD_(4)^(+)T/CD_(8)^(+)T、NK/CD_(8)^(+)T有关。

关键词： 多重微球流式免疫荧光法   细胞因子   参考区间  

摘要： 目的:基于多重微球流式免疫荧光法(MBFFI)初步建立成人血浆12种细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、IFN-α、TNF-α)的参考区间。方法:收集2022年1月至2023年12月于徐州市中心医院体检的140例健康成人血浆标本,采用流式细胞仪、青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司以及泰州谱迪生物科技有限公司试剂盒分别检测血浆中12种细胞因子的水平,并建立参考区间。结果:12种细胞因子均呈非正态分布,而且两家检测试剂95%参考区间存在差异。青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司生产的12项细胞因子试剂盒参考区间为IFN-α:<4.91 pg/ml、IL-12 p70:<1.95 pg/ml、IL-5:<12.72 pg/ml、IL-8:<60.68 pg/ml、IL-1β:<27.67 pg/ml、IL-2:<5.01 pg/ml、IL-4:<1.22 pg/ml、IL-6:<6.11 pg/ml、TNF-α:<2.92 pg/ml、IL-17:<10.27 pg/ml、IL-10:<6.88 pg/ml、IFN-γ:<17.68 pg/ml;泰州谱迪生物科技有限公司生产的12项细胞因子试剂盒参考区间为:IFN-α:<4.05 pg/ml、IL-12 p70:<7.33 pg/ml、IL-5:<7.80 pg/ml、IL-8:<13.24 pg/ml、IL-1β:<19.24 pg/ml、IL-2:<2.42 pg/ml、IL-4:<0.99 pg/ml、IL-6:<2.10 pg/ml、TNF-α:<0.87 pg/ml、IL-17:<1.42 pg/ml、IL-10:<1.10 pg/ml、IFN-γ:<1.34 pg/ml。结论:本研究应用MBFFI初步建立了两家试剂检测健康成人血浆12种细胞因子的参考区间,为临床相关疾病的诊治提供了重要参考。

关键词： 血管性血友病因子   免疫比浊法   全自动血凝分析仪   性能验证  

摘要： 目的对Sysmex CS-5100全自动凝血分析仪(简称CS-5100)检测血管性血友病因子(vWF)抗原(Ag)及活性(Ac)的性能进行验证及评估。方法参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)相关文件、WS/T406-2012、医学实验室质量和能力认可准则和厂家要求分别对德国Siemens厂家生产的免疫比浊法检测试剂盒vWF:Ag和vWF:Ac在CS-5100分析仪上的精密度、准确度、线性范围、携带污染、最大稀释度、参考区间、仪器间比对等性能进行验证。结果vWF:Ag的批内精密度为1.07%、2.71%,日间精密度为1.72%、3.95%,vWF:Ac的批内精密度为1.56%、3.56%,日间精密度为4.55%、5.49%;准确度验证结果在允许范围内;vWF:Ag线性范围为73.80%~171.05%(Y=0.996 X+1.0265,a=0.996,R^(2)=0.999),vWF Ac正常活性线性范围为35.43%~132.37%(Y=0.9982 X+1.6144,a=0.998,R^(2)=0.999),vWF:Ac低值活性线性范围为4.35%~29.93%(Y=0.9973 X+0.1511,a=0.9973,R^(2)=0.999);vWF;Ag携带污染率为0.55%,vWF:Ac携带污染率为0.17%;vWF:Ag和vWF:Ac的最大稀释度为1∶8;Siemens厂家生产的试剂盒提供参考范围适用于本实验室;CS-5100与ACL TOP700仪器间比对结果相关性较好,R^(2)>0.95符合验证要求。结论德国Siemens厂家生产的免疫比浊法检测试剂盒vWF:Ag和vWF:Ac在CS-5100分析仪上检测结果可靠、准确,具有良好的检测性能,能满足临床实验室工作需求。

关键词： 乳腺癌   黄芪解毒汤   阿霉素   白细胞介素-6   凋亡周期   侵袭  

摘要： 目的 探究黄芪解毒汤含药血清对乳腺癌细胞增殖、迁移、细胞周期的调控作用及机制。方法 MCF7细胞分为正常对照组(正常培养MCF7细胞)、空白血清组(MCF7细胞加入5 ml含有20%空白血清)、黄芪解毒汤血清组(MCF7细胞加入5 ml含有20%黄芪解毒汤血清)及阿霉素血清组(MCF7细胞加入5 ml含有20%阿霉素血清),采用噻唑蓝(MTT)检测细胞活性;流式细胞仪检测凋亡率及凋亡周期;Transwell小室法检测侵袭数目;划痕试验检测细胞迁移;Western印迹检测白细胞介素(IL)-6、糖蛋白(gp)130、转录激活因子(STAT)3、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白水平。结果 正常对照组及空白血清组MCF7细胞活性、凋亡率、凋亡周期、侵袭数目、划痕愈合率、IL-6、gp130、STAT3、p38MAPK蛋白表达无显著差异(P>0.05)。与空白血清组相比,黄芪解毒汤血清组MCF7细胞活性、侵袭数目、划痕愈合率、IL-6、gp130、STAT3、p38MAPK蛋白表达、凋亡周期G0~G1期显著降低,凋亡率、S期及G2~M期显著升高(P<0.05)。与黄芪解毒汤血清组相比,阿霉素血清组MCF7细胞活性、侵袭数目、划痕愈合率、IL-6、gp130、STAT3、p38MAPK蛋白表达显著降低,凋亡率显著升高(P<0.05),而IL-6、gp130、STAT3、p38MAPK蛋白表达无显著差异(P>0.05)。结论 黄芪解毒汤含药血清可降低乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移,调节凋亡周期而促进凋亡,机制可能与调节IL-6/gp130信号通路相关。