关键词:
圆锥角膜
动物模型
角膜形态
生物力学
弹性模量
蠕变
基质重塑
摘要:
圆锥角膜(Keratoconus)是一种以角膜变薄、失去正常弧度而发生锥形变形为特征的角膜扩张性疾病,是常见的眼科致盲疾病之一。临床表现为不规则散光和高度近视,青少年多发,严重损伤视力,部分患者不得不接受角膜移植。研究表明圆锥角膜的在体与离体生物力学性能降低。目前圆锥角膜的发病机制尚不清楚,患者病程差异大,且圆锥角膜样本来源受限。因此,建立接近临床圆锥角膜特征的动物模型对于圆锥角膜治疗的新方法的研究具有重要意义。近年来,有学者采用胶原酶法建立了圆锥角膜动物模型,但仍缺乏对该动物模型系统、全面的评价。
本文选取新西兰大白兔,利用Ⅱ型胶原酶浸润中央角膜,建立了圆锥角膜动物模型,动态跟踪了造模后不同时间(2周、4周及8周)的角膜在体形态学与在体生物力学行为的变化;研究了造模后角膜局部与整体材料力学性能的差异;分析了角膜组织与细胞水平基质重塑相关蛋白的变化,对该模型的有效性和稳定性进行了全面系统评价。在此基础上,对该模型在核黄素-紫外线A角膜交联术上的应用进行了初步研究。本文主要工作如下:
1.制备了圆锥角膜动物模型,研究了角膜在体形态随时间的变化规律:区别于之前的圆锥角膜动物模型,本文通过将5 mg/ml的Ⅱ型胶原酶作用于中央直径4 mm内的角膜,更符合临床圆锥角膜的锥体大小。在造模后不同时间(2周、4周及8周)采用Pentacam与SD-OCT检测角膜的在体形态学变化,对该动物模型角膜形态学的有效性与稳定性进行了评估。结果表明,造模后2周,角膜上皮恢复良好;造模后8周,角膜保持透明,表面光滑无异物,无新生血管生成。与造模前角膜相比,造模后角膜中央厚度明显减小,4周时最低;角膜曲率升高,后表面高度增加。造模后8周时角膜持续膨隆,角膜厚度虽有所增加,但仍低于造模前。
2.研究了圆锥角膜动物模型角膜在体生物力学行为随时间的变化规律:造模后不同时间(2周、4周及8周)采用Corvis ST检测角膜的在体生物力学参数变化,对该动物模型角膜在体力学性能的有效性与稳定性进行了评估。与造模前相比,造模后不同时间最大压陷时角膜凹陷半径相关参数如HCR显著降低,Max Inverse Radius、IR、DAR 2 mm等显著升高,造模后A1 Defl Amp与HC Defl Amp也显著增高,提示造模后4周内角膜的在体力学性能显著降低。造模后8周时部分参数趋势发生变化,提示力学性能有所回升,但仍低于造模前。
3.研究了造模后角膜组织不同区域的材料力学性能之间的差异,为圆锥角膜的治疗(如个性化定制角膜胶原交联术)以及圆锥角膜理论分析等提供参考。采用拉伸实验检测了离体角膜组织的整体与中央区域的各向异性和粘弹性性能。结果显示,与未处理的对照组相比,模型组角膜整体与中央区域的弹性模量均显著降低,且模型组中央角膜的弹性模量显著低于整体角膜。胶原酶处理后角膜的力学各向异性未发生明显改变。蠕变结果显示,造模后4周模型组角膜的蠕变率与整体变形率均高于对照组,瞬时模量与平衡模量均小于对照组。提示胶原酶处理使角膜的粘弹性发生了改变。造模8周时,模型组角膜的弹性模量仍低于对照组。
4.从组织和细胞分子生物学水平研究了造模后不同时间点角膜的组织结构及与角膜基质重塑相关蛋白表达变化规律,为评价此类动物模型提供了生物学参考。H&E染色结果显示,造模后8周内角膜上皮恢复良好,组织结构完整,未发现内皮层或后弹力层破损,未见明显炎症细胞浸润与新生血管生成。天狼猩红染色与透射电镜结果表明,造模后角膜中胶原含量降低,胶原纤维直径减小。角膜组织中促炎因子与基质重塑相关蛋白的免疫组化结果显示,造模后各时间点白介素(IL-1β、IL-6与IL-8)与基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2与MMP9)的表达均高于对照组,α-SMA的表达在造模后显著增加,且在造模后8周最高。造模后4周内角膜基质细胞中的促炎因子与基质重塑相关基因表达低于对照组;COL1A1、COL1A2与COL3显著升高;α-SMA的基因表达在造模后8周显著升高。该结果提示,造模后无论从角膜基质组织水平,还是细胞水平,促炎因子与基质降解相关蛋白表达均发生变化,在造模8周后可能有角膜瘢痕产生的风险。
5.初步探索了核黄素-紫外线A角膜交联新方法对该动物模型的治疗效果。采用9m W/cm2、10 min富氧(氧气浓度>95%)的紫外线A对造模4周时的角膜进行交联,检测了交联后4周时角膜的在体形态学、在体力学与离体力学性能变化。结果显示,与造模8周的圆锥角膜相比,交联后4周时,角膜形态学参数Km F显著减小,在体生物力学参数A1V显著降低,且不同方向不同区域的角膜弹性模量均高于造模组,提示该动物模型可以作为角膜交联治疗新方法的研究。
综上,采用胶原酶浸润角膜基质制备的圆锥角膜动物在早期(8周之内)角膜形态学与力学参数的变化与