关键词:
脱细胞
水凝胶
3D打印模具
抗凝血性能
形态可控
摘要:
心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)和血管创伤在人群中是一种常见问题,且死亡率很高。通过模拟人体自身血管的结构和功能可以构建出不同尺寸的人工血管。然而,小直径人工血管(d<6 mm)的性能仍存在诸多限制,比如容易导致血栓、机械性能差、形状单一等。水凝胶在组织工程血管领域备受关注,通常是由天然或合成聚合物制备而成,高含水度和多孔结构赋予了其与天然生物组织相似的特性,还可以作为药物载体。三维(Three dimensional,3D)打印可以根据个体的需求创造定制化的解决方案。但由于水凝胶的特殊性,通过3D打印制备复杂形状的空腔时仍有难度。针对上述问题,本文基于天然猪心主动脉血管脱细胞基质(Decellularized extracellular matrix,dECM),结合甲基丙烯酰化明胶(Methacrylated gelatin,GelMA)和聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)制备预凝胶溶液,并通过3D打印将设计的模型用白色树脂打印成牺牲模具,预凝胶溶液注入模具并交联后得到形状各异的组织工程人工血管,对其理化性能及生物相容性进行研究,并引入抗凝药物肝素来优化其抗凝血性能。
首先,采用多种组合方法对猪心主动脉血管进行脱细胞,得到主动脉血管dECM。对脱细胞前后血管进行扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)和染色观察,并且对胶原蛋白、糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)、DNA含量进行了检测。染色结果证明了dECM能够保留大量的胶原蛋白、弹性蛋白、GAGs,同时有效去除了细胞。定量结果中得到dECM中的胶原蛋白、GAGs和DNA的含量分别为54.33±8.14μg/mg,34.25±3.3μg/mg和48.71±12.00 ng/mg。结果表明,该脱细胞方法具有较为显著的脱细胞效率。明胶(Gelatin,Gel)是胶原蛋白的衍生材料,具有优异的生物相容性、非免疫原性,但其机械性能有限。为了改善力学性能,本研究在Gel上接枝甲基丙烯酸酐制备了GelMA。
尽管制备了机械性能增强的GelMA,但其力学性能仍然无法满足人工血管的需求。因此,本研究引入具有良好生物相容性的合成聚合物PVA,通过反复冻融和紫外光交联制备了具有良好机械性能和生物相容性的双交联水凝胶管。并通过3D建模软件调整参数,设计了不同的组合模具,使其能够实现等径、变径、Y型分叉等形状水凝胶管的制备。SEM结果显示水凝胶管具有多孔结构适宜细胞生长,傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)也证实了三种材料的成功引入。同时,改变水凝胶中不同组分的含量可以调控其溶胀率、吸水率等物理化学性能。水凝胶管的极限拉伸应力最高可达1.08±0.10MPa,断裂伸长率最高为204.78±14.83%。水凝胶管能在28 d时降解50%左右,且降解过程仍能保持结构的完整性。溶血率均符合生物材料的标准(<5%),并且具有一定的延长凝血时间效果。细胞实验也证明了L929细胞能在水凝胶管上正常黏附和增殖。综合考虑水凝胶各方面性能,最终选取1.5d6P7G进行后续的性能优化实验。
为了实现更好的抗凝性能,本研究引入了抗凝药物肝素(Heparin,Hep),并将1.5d6P7G水凝胶管作为载药系统制备出不同Hep负载量的水凝胶管。药物释放结果显示Hep的药物释放速率和Hep负载浓度基本无关,可在24 h左右释放完毕。溶血试验证明了1.5d6P7G-Hep水凝胶管具有较低的溶血率(<5%),能有效延长凝血时间,改善材料的抗凝性能。通过细胞实验证实了1.5d6P7G-Hep具有良好的生物相容性,Hep的负载浓度对水凝胶管的生物相容性无显著影响。