关键词:
犬
干眼症
脂肪间充质干细胞
富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白
摘要:
近些年来,随着经济高速发展,人们生活方式发生重大转变,用眼需求与日俱增,眼部疾病高发。与此同时,眼科疾病在兽医临床中也十分常见。随着城市化建设进程的加速,人们的精神文化生活不断改善,老龄化家庭等客观环境因素的出现,使得宠物犬成为了人们情感寄托的重要载体。此外,面对人类的不同需求犬也被赋予了各种职能,如搜救犬、缉毒犬、导盲犬等工作犬,因此犬的经济价值不可估量。我们需要保障犬的健康状态,以确保其工作效力,发挥社会价值及经济效益。在调查研究中发现,当前所有犬眼科疾病中,以干眼症居高,发病率呈逐年上升趋势,已经成为最普遍的眼科疾病之一。干眼症又称干燥性角膜结膜炎(Keratoconjunctivitis Sicca,KCS),是由于体内外原因引起泪腺分泌不稳定导致泪液质或量异常,进而引发角膜损伤、炎症、疼痛、发红及发痒等症状。尽管目前已有多种针对干眼症的药物上市,但都只能改善眼表的症状,且刺激性强,容易产生依赖型,不易长时间使用。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一类起源于中胚层的多能干细胞,具有多向分化、易分离获取、免疫原性低、不成瘤等特征,是近年来国内外干细胞科学研究、临床应用中最为广泛的类型。相比于其他类型的MSC,脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,ADMSC)因方便取材、无道德伦理争议等优势成为了最具治疗潜力的种子细胞。然而,ADMSC进行眼科治疗仍存在许多问题,如体外培养过程中细胞活力差,移植于受损部位存活率低等,使治疗效果大打折扣,所以急需探索一种能够提高ADMSC疗效的新方法。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine,SPARC)是一种存在于细胞外基质中的分泌蛋白,在细胞迁移、细胞粘附、细胞分化、细胞基质调节等过程中发挥重要作用,可以通过与细胞膜受体相互作用,促进细胞增殖能力及活性。因此,本实验通过构建过表达SPARC的ADMSC细胞系,针对SPARC对ADMSC生长、细胞增殖等能力的影响,以及SPARC修饰的ADMSC对犬干眼症的治疗效果及对角膜上皮细胞损伤的挽救能力,进行了相关实验。得到以下结果:
(1)细胞实验:通过慢病毒转染法构建ADMSC-OESPARC及ADMSC-CMV细胞株,对两支细胞株进行细胞生长、增殖能力检测发现,SPARC能够显著提高ADMSC细胞活性及增殖速率,联合RNA-Seq技术分析表明SPARC可以调节ADMSC在损伤修复方面的信号通路,特别是脂质合成、血管发育、细胞黏附、胶原组织纤维调控、抗炎等生物过程,从而提高ADMSC对于角膜上皮愈合生长的能力。
(2)动物模型疗效评价:将15只中华田园犬分为正常组、干眼症自愈对照组、环孢素(Cyclosporine)治疗组、ADMSC-CMV治疗组、ADMSC-OESPARC治疗组,配置0.25%的苯扎氯铵(Benzalkonium Chloride,BAC)溶液,连续于犬眼球中央点眼7天诱导中重度犬干眼症模型,第8-15天分别使用环孢素滴眼液、含1x10~6 ADMSC-CMV或ADMSC-OESPARC的细胞悬液进行治疗。根据干眼症临床评级标准及病理组织切片和血清学检查,证明SPARC可以加强ADMSC对干眼症犬角膜红肿及泪液分泌的恢复能力,提高对瞬膜腺、角膜组织的修复效果,犬机体炎症水平显著下调,角膜组织细胞增殖加快。说明SPARC可以加强ADMSC的治疗效果,以便更好地在临床中推广应用。
(3)细胞模型疗效评价:在人角膜上皮细胞(Human Corneal Epithelial Cells,HCEC)中添加1μg/m L苯扎氯氨溶液损伤进行体外角膜损伤模型的建立,在损伤的HCEC中加入ADMSC-CMV或ADMSC-OESPARC上清液进行非接触式二维共培养,通过细胞划痕、CCK8、Giemsa染色、流式细胞术、细胞免疫荧光等实验表明,SPARC能够提高ADMSC促HCEC迁移的能力,使损伤的HCEC基本恢复为形态正常的光滑致密椭圆形,释放的炎症介质IL-6、TNF-α、MMP-9显著下降,表皮生长因子EGF表达量上调,细胞晚期凋亡减少,PCNA、Ki67表达量上调,细胞增殖能力改善。说明SPARC能够提高ADMSC对损伤的HCEC的挽救效果。
本研究证明了SPARC的修饰提高了ADMSC体外培养的细胞活力,调节损伤修复相关的信号通路,对干眼症模型犬的治疗效果及角膜上皮细胞体外损伤模型的挽救效果均优于单独使用ADMSC,为SPARC与ADMSC联合治疗作为新型干眼症疗法提供重要证据,也为细胞疗法在未来的临床应用中提供新策略。