关键词:
阳离子脂质体
核酸
纳米毒性
生物安全性
血管内皮细胞
炎症反应
摘要:
研究背景与目的:纳米医学领域的兴起已经深刻改变了精准医学的格局,为疾病诊断、治疗和疫苗开发提供了新的途径。在不同类型的纳米药物载体中,阳离子脂质体(CLN)已在基因治疗中崭露头角,成为药物递送应用中一种有前景的非病毒载体。自脂质体于1965年被发现以来,技术进步使得阳离子脂质体在携带核酸药物,特别是开发预防性m RNA疫苗(如针对新冠病毒的疫苗)方面取得了重大进展。阳离子药物载体的表面正电荷增强了其与细胞膜的相互作用能力,促进了细胞吞噬,但同时也提高了产生细胞毒性作用的可能。这些毒副作用引起了人们的关注,尤其是在全身给药的情况下,成为其临床应用的一个主要障碍。阳离子脂质体与质粒DNA结合形成复合物的毒副作用引人注意,因为这种效应并非由阳离子脂质或DNA单独造成。阳离子脂质体与质粒DNA复合物在系统给药后与体内多种细胞相互作用,引发各种毒副反应,进而影响其安全性。尽管如此,关于其引发的细胞毒性和炎症反应的机制研究仍然较少。多年以来,这些复合物引起的细胞毒性、炎症反应和生物安全性问题,尤其是在系统给药的情况下,极大地阻碍了基因疗法的发展。对于这些问题,我们迫切需要进行更深入的研究。已有研究证明,阳离子脂质体与质粒DNA复合物能够导致慢性炎症反应。然而,其能否引起急性炎症反应尚未得到证明。本论文利用一种基于阳离子脂质、卵磷脂的阳离子脂质纳米颗粒及其与质粒DNA的复合物(CLN/DNA),在体内外全面评估CLN/DNA的细胞毒性和炎症反应,阐释阳离子脂质体/DNA复合物和单独阳离子脂质体引发不同毒性效应的具体机制。我们旨在揭示导致毒性的关键因素,并为设计更安全的基因递送载体提供指导。研究方法:1.制备并表征了阳离子脂质体纳米颗粒(CLN)和其与质粒DNA形成的复合物(CLN/DNA)。2.通过小动物成像、流式细胞术(FCM)、激光共聚焦荧光显微镜(LSCM)成像和免疫荧光染色方法检测CLN和CLN/DNA纳米颗粒在小鼠体内的分布以及与血管内皮细胞的相互作用。酶联免疫吸附(ELISA)实验用于检测CLN/DNA引起的血管内皮损伤。3.通过LSCM、FCM和免疫荧光染色等方法在体外检测CLN和CLN/DNA纳米颗粒被血管内皮细胞摄取的情况,以及溶酶体逃逸和线粒体损伤。透射电子显微镜(TEM)用于观察纳米颗粒对血管内皮细胞中线粒体结构和数量的影响。4.通过ELISA、LSCM成像和免疫荧光染色等方法检测损伤相关分子模式(DAMP)和细胞因子的释放。应用流式细胞术进一步检测CLN/DNA对免疫细胞和造血干细胞的影响。最后,观察了CLN/DNA处理对小鼠骨髓造血干细胞的干性的影响。研究结果:1.通过静脉注射携载质粒DNA的阳离子脂质复合物(CLN/DNA)会迅速对外周血产生影响,主要表现为血小板、白细胞以及淋巴细胞的数量减少,而对照组(阳离子脂质或质粒DNA)处理小鼠体内没有检测到相应变化。***/DNA纳米颗粒能够在免疫细胞和造血干细胞(LSK)中富集。3.静脉注射的CLN和CLN/DNA主要积聚在肝脏、脾脏和肺脏等器官。CLN和CLN/DNA显著富集在主动脉、肺脏和肝脏的血管内皮细胞,但CLN/DNA与血管内皮细胞的相互作用更显著。CLN/DNA导致血清中血栓调节蛋白的水平显著增加,表示其诱导血管内皮细胞发生损伤。而CLN则不产生这种现象。4.在体外实验中发现,CLN由于带有较高的正电荷,更容易被EOMA细胞摄取。但是,CLN和CLN/DNA的都能从溶酶体逃逸出来进入胞质中。CLN/DNA能够降低EOMA细胞中线粒体膜电位,降低细胞内ATP的产生,导致线粒体数目减少和结构改变。CLN/DNA显著提高了EOMA细胞表面的CRT表达水平,表明其诱导内皮细胞免疫原性死亡的作用。5.在体内实验中发现,静脉注射的CLN/DNA纳米颗粒提高了HMGB1和ATP的水平,增加小鼠肺和肝组织细胞表面暴露的CRT水平。与CLN相比,CLN/DNA显著增加了细胞因子(IFN-γ,IL-6和TNF-α)的释放,尤其是血液中IFN-γ的浓度升高了近百倍,活化的NK细胞是IFN-γ的主要来源。CLN/DNA降低了血液中血小板、白细胞和淋巴细胞的数量,而CLN没有产生这些作用。6.相比于CLN,CLN/DNA处理提高了造血干细胞和前体细胞产生的比例,导致HSC的增生,但这些增生的HSC并不具备骨髓重建血细胞的能力。研究结论:本研究揭示了CLN/DNA诱导血管内皮细胞损伤的机制,证明了CLN/DNA诱导线粒体功能障碍和血管内皮细胞死亡之间的关系。全身给药后,CLN/DNA诱发的细胞因子和炎症相关分子的释放,引起了造血干细胞的应激增生,并影响了骨髓重建血细胞的能力。特别是,免疫细胞如NK细胞产生的细胞因子如IFN-γ,IL-6和TNF-α在CLN/DNA诱导的应激造血过