关键词:
干眼症
冬凌草甲素
NLRP3
GSDMD
细胞焦亡
摘要:
背景:干眼症(Dry eye diease,DED)是一种以泪液成分异常和眼表炎症为特征的慢性眼表疾病,目前对于干眼症的病理生理学机制尚未完全阐明,但慢性炎症恶性循环已被认为是DED发生发展的核心驱动力之一。近年研究发现NOD样受体3(NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)/细胞焦亡蛋白gasdermin D(GSDMD)通路诱导的细胞焦亡或许是DED炎症恶性循环的关键机制之一。冬凌草甲素(Oridonin,Ori)是冬凌草(Rabdosia Rrubescens)中分离得到的具有抗炎作用的天然物质,其对多种炎症性疾病发挥抗炎作用,例如角膜炎,肺炎,结肠炎等,研究表明NLRP3是Ori发挥抗炎活性的靶点。本研究以干眼症体内外模型为切入点,探究DED慢性炎症中可能存在的机制,以及Ori能否对DED发挥抗炎作用及其作用机制。
目的:探究Ori对高渗诱导的人角膜上皮细胞焦亡途径NLRP3/caspase-1/GSDMD的影响作用,以及对于干眼症小鼠模型眼表症状的疗效及作用机制。
方法:1.不同渗透压(312、450、500、550 mOsm/L)培养基刺激永生化人角膜上皮细胞系(human corneal epithelial cell-transformed,HCE-T),观察不同渗透压下细胞的形态学改变。2.利用细胞划痕实验,检测不同渗透压下HCE-T细胞的迁移和愈合能力。3.利用细胞活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8),检测Ori对于HCE-T细胞活性的影响作用,筛选药物非毒性浓度范围,同时检测高渗刺激下细胞活性的改变。4.将HCE-T细胞按照处理不同分为4组,等渗培养基培养的HCE-T细胞为正常对照组(normal control,NC组);用500 mOsm/L培养基的HCE-T细胞为干眼组(DE组);髙渗培养基和Ori药物组(DE+Ori组),为了找到最佳有效浓度,发挥Ori的抗炎作用,将药物组分为DE+2μM/L Ori及DE+4μM/L Ori两组。检测四组下NLRP3、caspase-1、IL-1β、全长gasdermin D(FL-GSDMD)、活性片段N-GSDMD的表达水平。5.将80只同周龄的C57BL/6J小鼠按照随机抽样的方法分成4组,正常对照组(NC组);苯扎氯铵(Benzalkonium chloride,BAC)点眼为干眼组(DE组);BAC合并DMSO点眼组(DE+DMSO组),BAC联合Ori点眼组(DE+Ori组)。6.造模成功或药物干预后,采用角膜荧光素钠染色法和泪液体积测量评估小鼠眼表变化。7.收集不同实验组小鼠的角结膜组织,检测小鼠角结膜组织中白介素因子1β(Interleukin factor 1β,IL-1β)、NLRP3、caspase-1、FL-GSDMD、N-GSDMD的表达水平。
结果:我们的研究表明,1.在312-550mOsm/L之间,随着渗透压的升高,细胞皱缩,体积缩小,细胞形态由原先的椭圆状变为细长状,悬浮死亡的细胞数量增多。2.在312-550mOsm/L之间,随着渗透压的增高,HCE-T细胞的愈合和迁移能力明显下降,在550mOsm/L时,最为显著。3.高渗透压刺激会导致N-GSDMD蛋白表达水平上升,并且随着渗透压的增加,N-GSDMD的表达也逐渐增加,当渗透压为500 mOsm/L时,N-GSDMD的蛋白表达水平达到峰值。***(2-20μM)剂量依赖性地抑制了HCE-T细胞的活性(24 h时的IC50值为12.44±0.23μM),而2-4μM Ori可以显著保护HCE-T免受高渗刺激诱导的细胞毒性。***体外模型中,NC组和DE+Ori组相比较DE组HCE-T细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β的m RNA和蛋白质表达水平下降显著。6.小鼠DED模型实验发现,DE小鼠中角结膜组织检测的IL-1β的蛋白表达水平较正常饲养的小鼠相比较升高较为明显。DE+Ori组与DE组干眼模型小鼠的相比较,小鼠角膜荧光染色评分显著降低而泪液体积显著增加,WB实验检测结果表明NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白质表达水平显著性下降。
结论:1.N-GSDMD的表达水平与渗透压呈正相关,当渗透压达到500 mOsm/L时表达最为显著;***保护人角膜上皮细胞免受高渗溶液的损伤,减轻干眼症小鼠的症状及体征,可能与抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径有关,表明Ori在治疗干眼症具有潜在的应用前景,可为治疗DED提供潜在的新疗法,并为Ori治疗DED提供理论依据