关键词:
角膜新生血管
原花青素
双氯芬酸钠
地塞米松
纳米酶
摘要:
目的:
角膜新生血管(CNV)是由于角膜炎症、外伤和角膜移植手术等导致的一种损害视力甚至导致眼盲的疾病。其主要治疗药物如类固醇和非甾体类消炎药等,存在引起眼压高、眼刺激及角膜溶解等副作用。为减少副作用,本研究制备了一种铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶(PC-DS NE),研究其多酶活性及药物释放效果,评价其生物相容性,同时评估其清除活性氧(ROS)、抗炎、促进组织修复和控制CNV的效果。
方法:
(1)PC-DS NE的制备与表征:通过搅拌、离心、透析和冷冻干燥制备PC-DS NE。测量其pH值和不同浓度下的吸光度值,并通过透射电子显微镜(TEM)、能量色散光谱仪(EDS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线光电子能谱技术(XPS)和电子自旋共振(ESR)进行形貌和性质表征。使用超高效液相色谱仪(UPLC)评价PC-DS NE药物递送的功能。
(2)PC-DS NE的特性:通过四甲基联苯胺(TMB)比色实验、邻苯二胺(POD)比色实验和超氧化物歧化酶(SOD)活性实验测量PC-DS NE的多酶活性,通过羟自由基抑制实验分析PC-DS NE体外清除ROS的能力。
(3)细胞实验:通过CCK-8实验和活死细胞染色评估PC-DS NE的体外生物相容性,在细胞水平评估PC-DS NE的体外ROS清除能力,并通过骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的脂多糖(LPS)刺激实验探究PC-DS NE的体外抗炎活性,通过细胞划痕实验观察PC-DS NE促进角膜上皮细胞迁移、增殖和修复的能力,通过脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管实验观察PC-DS NE抑制内皮细胞血管形成的功能。
(4)动物实验:通过眼刺激实验评估材料体内生物相容性,使用小鼠滴眼实验评价纳米酶的药物停留时间,利用新西兰大白兔评价纳米酶的体内药物渗透性。通过小鼠角膜上皮损伤修复模型和角膜神经染色铺片分析PC-DS NE促进角膜上皮和神经修复的功能。通过小鼠碱烧伤CNV模型及病理、免疫、分子生物学和蛋白质组学等分析,评估PC-DS NE体内ROS清除、抗炎和抑制CNV的功能,同时分析PCDS NE治疗碱烧伤的疗效。
结果:
(1)纳米酶的制备与表征:5 mg/mL的PC-DS NE溶液的pH值经pH计测定为5.85±0.02。紫外分光光度测量(UV-Vis)显示PC-DS NE的主要吸收峰在280nm处。浓度低于2 mg/mL的PC-DS NE溶液在波长大于300 nm处几乎没有明显的吸光度。TEM显示PC-DS NE为类球状形貌,粒径为39.73±5.18nm。EDS和XPS显示PC-DS NE具有C、N、O、S、Cl和Fe等元素。FTIR分析显示了原花青素、双氯芬酸钠特征峰,而这些特征峰的强度在PC-DS NE的FTIR中均明显下降。说明原花青素和双氯芬酸钠成功制备了PC-DS NE。UPLC结果显示,PC-DS NE中的原花青素48 h内先快速释放,48 h后平稳释放,而PC-DS NE中的双氯酸芬钠在48 h内迅速释放,48 h后缓慢释放。表明PC-DS NE是一种新型药物递送系统。药物停留实验显示,对照组(PBS)滴眼30 min后没有明显的PBS残留,而PC-DS NE组于60 min后仍有PC-DS NE溶液残留,PC-DS NE组60 min的药物停留百分比要显著高于对照组(P<0.05),说明PC-DS NE具有更长的药物停留时间。体内药物渗透试验显示,从15 min到120 min,在新西兰大白兔房水中,原花青素浓度呈逐渐上升的趋势,而双氯芬酸钠浓度呈先上升后下降的趋势,说明双氯芬酸钠在体内也能快速释放,与体外药物释放实验结果呈现类似的效果。
(2)多酶活性评价:TMB实验说明PC-DS NE具有类过氧化物酶活性,37℃时类过氧化物酶活性最高,具有浓度依赖性。POD实验说明,酸性条件下,PC-DS NE过氧化物酶活性较高。邻苯三酚自氧化实验显示,PC-DS NE能明显降低产物在320 nm处的吸收峰,说明PC-DS NE具有超氧化物歧化酶活性。ESR分析显示,PCDS NE与H2O2相互作用时有明显信号,而单独检测PC-DS NE或H2O2时,这些信号显著减弱。说明H2O2存在时,PC-DS NE具有催化H2O2产生羟自由基的作用。
(3)生物相容性分析:CCK-8实验显示,0.1 mg/mL PC-DS NE组与对照组、0.01 mg/mL PC-DS NE与对照组的人角膜上皮细胞(HCEC)及人角膜基质细胞(HCSC)细胞活性均无明显差异(P>0.05)。活死细胞染色显示,对照组和0.1mg/mL PC-DS NE组均没有出现红色荧光,相较于对照组,0.1 mg/mL PC-DS NE组HCEC绿色荧光明显增多。PBS组与5 mg/mL PC-D