关键词:
                            
                                
                                    肝细胞癌
                                
                                 
                                    自噬
                                
                                 
                                    LC3抑制剂
                                
                                 
                                    Sorafenib
                                
                                 
                                    Oxaliplatin
                                
                     
                    
                    
                    
                            摘要:
研究背景及目的肝癌是我国主要的几种恶性肿瘤之一,具有早期诊断难、治疗后易复发、治疗手段单一等特点,依旧是未来癌症研究的重中之重。自噬普遍存在于各种肿瘤细胞的一种生理活动,是抗癌药物治疗过程中肿瘤细胞产生耐药或者对药物敏感性下降的重要原因之一。LC3作为自噬形成过程中的重要分子,与肝癌患者的预后密切相关。本实验着重探究新型小分子药物D5对自噬形成的关键蛋白LC3的抑制作用,并与临床常见的一线抗癌药物Sorafenib及Oxaliplatin联用,判断其是否与这些抗癌药物有协同作用,为D5进入临床试验提供前期研究基础。实验方法一、探究LC3B的表达水平与HCC患者预后相关性(一)LC3B在肝癌组织内的表达情况收集临床患者肝癌及癌旁组织标本,记录对应编号,制备相应c DNA进行q PCR扩增LC3 m RNA。对比癌和癌旁组织内m RNA表达水平。(二)LC3B表达水平与患者预后关系1、收集临床患者肝癌及癌旁组织标本,记录对应编号,制备相应c DNA进行q PCR扩增LC3 m RNA。将患者的LC3 m RNA水平与患者预后数据整合后绘制生存曲线;2、将预制好的肝癌患者组织芯片进行常规LC3免疫组化染色,软件分析记录患者癌和癌旁组织内阳性染色积分,与患者临床预后数据整合后绘制生存曲线。二、新型靶向LC3小分子药物D5对肝癌细胞自噬流形成及恶性行为的影响(一)小分子药物D5对肝癌细胞自噬的影响1、利用细胞毒性IC50实验确定给药浓度后选择IC50、1/2 IC50、1/4 IC50作为给药浓度进行后续实验;2、向细胞培养基中加入相应浓度的药物,收取48 h细胞蛋白样品进行WB分析;3、利用m RFP-GFP-LC3双标腺病毒感染肝癌细胞后给予相应浓度药物处理相应时间,使用激光共聚焦显微镜拍照,计算自噬体与自噬溶酶体个数,计算比例,判断各组自噬流变化方向;4、用相应浓度药物处理细胞相应时间,收集后用电镜固定液固定细胞,送样拍照。(二)小分子药物D5对肝癌细胞增殖的影响用相应浓度的药物处理细胞,通过CCK8(cell counting kit-8)试剂盒检测小分子药物D5对肝癌细胞增殖能力的影响。(三)小分子药物D5对肝癌细胞凋亡的影响1、用相应浓度的药物处理细胞,通过TUNEL试剂盒对肝癌细胞内DNA断裂进行染色,激光共聚焦显微镜拍照分析;2、用相应浓度的药物处理细胞,通过凋亡流式染色试剂盒对细胞进行Annexin V-FITC/PI双重染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。(四)小分子药物D5对肝癌细胞迁移及侵袭的影响用相应浓度的药物处理细胞,通过Transwell小室实验比较不同浓度的药物对细胞迁移及侵袭能力的影响。三、探究小分子药物D5与Sorafenib联用对肝癌细胞恶性行为的抑制效果(一)小分子药物D5与Sorafenib联用对肝癌细胞药物敏感性的影响将96孔板内的细胞分为Sorafenib组与Sorafenib+D5组,均使用相同浓度梯度的Sorafenib处理细胞。Sorafenib+D5组则在Sorafenib处理基础上加入固定浓度的小分子药物D5,判断小分子药物D5是否能使肝癌细胞对Sorafenib更加敏感。(二)小分子药物D5与Sorafenib联用对肝癌细胞增殖的影响将96孔板内的细胞分为对照组、D5组、Sorafenib组与Sorafenib+D5组,给予相应药物处理,每组设置3个复孔,每天用CCK8试剂盒检测不同药物组合对肝癌细胞增殖能力的影响。(三)小分子药物D5与Sorafenib联用对肝癌细胞凋亡的影响1、将细胞分为对照组、D5组、Sorafenib组与Sorafenib+D5组,制作细胞爬片,给予相应药物处理,相应时间后收取细胞爬片,进行TUNEL染色,激光共聚焦显微镜拍摄照片,分析结果;2、将细胞分为对照组、D5组、Sorafenib组与Sorafenib+D5组,给予相应药物处理,相应时间后收取细胞,用Annexin V-FITC/PI双重染色,使用流式细胞仪检测凋亡细胞比例。(四)小分子药物D5与Sorafenib联用对肝癌细胞侵袭及迁移的影响将细胞分为对照组、D5组、Sorafenib组与Sorafenib+D5组,利用Transwell小室系统培养细胞,给予相应的药物,处理相应时间后使用结晶紫染色,拍照分析。(五)小分子药物D5对Sorafenib导致的肝癌细胞自噬流形成的影响1、利用m RFP-GFP-LC3双标腺病毒感染肝癌细胞后将细胞分为对照组、D5组、Sorafenib组与Sorafenib+D5组,给予相应的药物处理后收取细胞爬片,激光共聚焦显微镜拍照,计算自噬体与自噬溶酶体个数,计算比例,判断各组自噬流变化方向;2、将细胞分为对照组、D5组、Sorafenib组与Sorafeni