关键词:
等温扩增
链置换扩增
分子信标
阻遏蛋白
半乳糖
抑制剂
摘要:
目的:代谢物存在于人体体液中,可作为具有医学意义的重要生物标志物。代谢物检测是生物学和医学领域的研究热点之一。目前很多代谢物检测方法存在灵敏度低、易受干扰、操作繁琐、依赖昂贵的仪器以及专业人员操作等不足,因此开发简单、快捷、易操作的代谢物生物传感器十分重要。基于转录因子的生物传感器(Transcription factor-based biosensors,TFBs)在代谢工程和合成生物学中发挥着重要的作用。TFBs能够感知代谢产物浓度信号,并将其转化为特定的输出信号。它们具有灵敏度高、特异性强、分析速度快等特点,被广泛应用于靶标代谢物的检测。链置换扩增(Strand displacement amplification,SDA)技术是重要的等温核酸扩增技术之一,该技术的原理及操作步骤简单,是近年来被广泛应用的一种DNA扩增技术。SDA技术的应用领域多数为检测蛋白质、核酸等,其对于小分子代谢物的检测尚有待探索。本研究选择一种原核生物转录因子:半乳糖阻遏蛋白(Galactose repressor,GalR),利用其调控链置换扩增技术建立半乳糖等代谢物的新的检测技术。方法:1、设计带有GalR识别序列的SDA模板及引物,利用GalR识别并结合DNA的作用抑制SDA扩增反应,半乳糖(D-galactose,D-Gal)通过特异性地结合GalR解除抑制作用,恢复SDA扩增反应,形成生物传感的“开关”机制。从而利用GalR特异性地调控SDA反应,达到检测半乳糖的目的。我们将此生物传感器命名为repressor-SDA。(1)原核表达纯化获得GalR蛋白。(2)设计带有GalR识别序列的SDA模板及引物,建立SDA反应体系。(3)通过GalR调控SDA反应建立repressor-SDA技术,并对该技术进行条件优化。(4)利用repressor-SDA技术检测D-Gal的方法学表征。2、SDA技术不仅扩增效率高、反应时间短、特异性强,而且易于偶联其他技术提升检测效能。催化发夹组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)恒温扩增技术是一种体外无酶扩增技术,因其操作简便、反应灵敏在现代分析领域中被广泛应用。本研究在repressor-SDA的基础上进一步偶联CHA技术,使D-Gal的检测得以进一步提升。(1)设计CHA反应中的H1/H2发夹以及荧光探针,建立CHA反应体系。(2)对CHA反应中的缓冲液以及H1/H2浓度进行优化。(3)建立repressor-SDA偶联CHA技术,提高对D-Gal的检测效能。(4)进行repressor-SDA技术偶联CHA技术检测D-Gal的方法学表征。3、repressor-SDA技术的概念验证依赖于转录因子GalR,检测对象仅限于半乳糖。为使该生物传感器可以检测更多靶标,扩展其应用范围,我们采用水解酶偶联repressor-SDA的策略,检测其他代谢物。以乳糖和蜜二糖作为检测模型,利用乳糖酶、蜜二糖酶分别分解乳糖、蜜二糖为半乳糖,引发repressor-SDA反应,使检测靶标范围得以扩展。(1)根据酶促反应原理利用乳糖酶分解乳糖。(2)利用repressor-SDA技术检测乳糖分解后的半乳糖从而对乳糖进行定量检测。(3)利用蜜二糖酶分解蜜二糖,偶联repressor-SDA对蜜二糖进行定性检测。4、抑制剂筛检有助于揭示抑制剂的分子作用机制,以及在药物开发和疾病治疗方面的应用。转录因子的抑制剂筛检技术不仅对揭示其调控机制有意义而且对医学实践如药物开发也发挥着重要作用。通过repressor-SDA技术验证筛选GalR转录因子抑制剂的可行性,并筛选出GalR的抑制剂,利用repressor-SDA技术进一步检测抑制剂的半数抑制浓度即IC。(1)验证IPTG的存在是否能使GalR对D-Gal的反应被抑制。(2)筛选不同种类的物质是否有抑制的效果。(3)验证IPTG的半数抑制浓度IC。结果:成功获得具有活性的GalR蛋白,建立了repressor-SDA新型生物传感器,通过分子信标(Molecular beacon,MB)实现了荧光信号的检测,优化了repressor-SDA体系中序列、两种酶的浓度以及GalR浓度,实现对小分子代谢物D-Gal的特异性检测,对D-Gal的检测限为2.70μM。通过偶联CHA扩增技术使对D-Gal的检测限得到进一步提升,联合CHA反应时优化了体系中所使用的buffer以及两个发夹的使用浓度,在最优的条件下,两种技术联合扩增检测D-Gal的检测限达到1.05μM,而且明显提高区分其他类型的单糖的特异性。通过增加一步酶促反应利用两种水解酶将检测对象扩展至乳糖、蜜二糖且验证成功,检测乳糖的检测限达到5.34μM。利用该技术筛查出GalR转录因子的三种抑制剂IPTG